Domeniul vizat: 6. Dezvoltarea capacității instituționale pentru cercetare în universități

Titlul proiectului: Centru zonal de referință pentru analiza metagenomică

Acronimul proiectului: MetaGen@Tm

Data de începere a proiectului: 29/03/2022

Data de finalizare a proiectului: 16/12/2022

Scopul proiectului: Prezentul proiect își propune extinderea expertizei de cercetare aplicată și fundamentală a Laboratorului de Diagnostic Biochimic și Molecular (LDBM) al UMF “Victor Babeș” Timișoara ca și Centru de Referință în Cercetarea Biomedicală al Consorțiului Timișoara Universitară, prin introducerea și diseminarea în comunitatea academică a tehnicilor de secvențiere metagenomică.

Cod proiect: CNFIS-FDI-2022-0423
In cadrul proiectului au fost realizate activități care conduc la următoarele rezultate:
R1.A.1. Ghid de proceduri de secvențiere 16S bazata pe tehnologia Nanopore A fost implementat protocolul de lucru pentru secvențierea 16S folosind kitul de secvențiere SQK-16S024 si secvențiatorul Minion MK1C. In pregătirea acestui protocol au fost explorate mai multe metode de purificare a ADN bacterian; a fost optimizata metoda de spălare a celulelor folosite (Flow Cell Wash Kit, EXP-WSH004), ceea ce a permis reutilizarea acestora (sub condiția existentei a cel puțin 800 de pori funcționali)
R1.A2. Set de minim 24 de amestecuri bacteriene complexe analizate prin secvențiere 16S Nanopore 
A fost folosit kitul de secvențiere 16S Barcoding Kit 1-24 (SQK-16S024) care permite analiza in paralel a 24 de amestecuri bacteriene complexe. Rezultatele experimentelor de secvențiere sunt stocate pe calculatoare de la sediul Laboratorului de Diagnostic Biochimic si Molecular (LDBM) si al Catedrei de Biochimie. Pentru optimizarea procedurilor de secvențiere au fost folosite standarde microbiene intestinale si microbiene comunitare; a fost optimizata procedura de purificare a ADN din probe fecale folosind ZR BashingBead Lysis Tubes si ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit.
R1.A3. Ghid de proceduri de secvențiere metagenomică
1) A fost implementat protocolul de lucru pentru secvențierea ADN bacterian folosind kitul de secvențiere SQK-LRK001 (varianta cold-chain free a kitului SQK-RAD004) si aparatul MK1C. Prepararea librăriilor se face in 10 minute urmând un protocol in două etape, folosind o transposază pentru clivarea aleatorie si etichetarea fragmentelor generate, de care, într-o etapa ulterioara, sunt atașați adaptorii de secvențiere rapidă.
2)A fost optimizat si implementat protocolul de lucru pentru secvențierea ADN bacterian folosind kitul de secvențiere SQK-RAD004 si aparatul Minion MK1C. Procedura se bazează pe clivarea transposazica aleatorie si etichetarea fragmentelor generate, urmata de atașarea adaptorilor de secvențiere rapida. In ambele situații, fluxul de lucru pentru a analiza datele este EPI2ME WIMP (What’s In My Pot) versiunea v2021.11.26 ce permite analiza in timp real si agregarea citirilor la nivel de specie conform taxonomiei NCBI. Pentru citirile fără o atribuire fiabilă la sunt utilizate ranguri superioare ale arborelui taxonomic. Dacă nicio poziționare nu este suficient de fiabilă, secvența este etichetată ca „Neclasificată”. Sunt in curs de optimizare protocoale de secvențiere rapida a ADN bacterian extras din urina si sputa, folosind o etapa intermediara de amplificare genomică folosind kituri Qiagen REPLI-g. Analiza ARM (Antimicrobial Resistance) (versiunea v2022.08.16-15679) ce permite detectarea genelor (plasmidiale sau genomice) de rezistenta la antimicrobiene este o extensie EPI2ME WIMP si a fost implementat implicit. Nicio gena de rezistenta nu a fost identificata pana in prezent.
R1.A4. Set de minim 12 amestecuri bacteriene complexe analizate
Au fost folosit kitul de secvențiere Field Sequencing si Rapid Sequencing pentru analiza a 12 amestecuri bacteriene complexe. Rezultatele acestor experimente de secvențiere sunt stocate pe calculatoare de la sediul LDBM si al Catedrei de Biochimie.
R1.A5. Materiale de curs accesibile in format printat si format digital
La trainingul de 16S sequencing (https://www.umft.ro/event/training-gratuit-tehnica-16s-nanopore/) din 29.11.2022 s-au înscris 7 participanți: 3 de la Facultatea de Medicina Dentara, 2 de la Clinica de Oncologie Oncohelp, 1 participant de la Universitatea de Vest, 1 participant de la Spitalul Clinic de Urgenta pentru Copii.
 
Au fost pregătite materiale care detaliază
  • -importanța analizei metagenomice in context clinic (comparativ cu alte metode de identificare bacteriana) – material powerpoint
  • procedurile de recoltare de probe biologice in vederea secvențierii 16S,
  • purificarea ADN bacterian
  • cuantificarea si caracterizarea ADN bacterian (HS dsDNA Assay kit optimizat pentru cuantificare fluoromoetrica QubiT)
  • prepararea librăriilor de secvențiere 16S in condiții de multiplexare
  • amorsarea celulelor de secvențiere R9.4.1 folosind Flow cell Priming Kit
  • încărcarea librăriilor pe celule de secvențiere (R9.4.1)
  • programarea si lansarea programului de secvențiere 16S pe MK1C
  • încărcarea rezultatelor brute (fastq) si analiza rezultatelor folosind suita EPI2ME 16S-BLAST.

Observatii.
1. Succesul programului desfășurat in cadrul LDBM a condus la decizia UMF Timișoara de a susține un proiect transfrontalier
de implementare a procedurilor de diagnostic bazate pe tehnicile metagenomice.
2. LDBM a fost contLDBM a fost contactat de către președintele Societății Romane de Bioinformatica in vederea
sponsorizării/găsirii unor modalități de extindere la nivel național a cursului de 16 sequencing.
3. A fost comandat un calculator performant dedicat exclusiv stocării si analizării rezultatelor de secvențiere.